概述：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題。本文締一生物為您分析細(xì)胞被支原體污染后的清除策略。

細(xì)胞培養(yǎng)中常遇見的有細(xì)菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。

說起支原體污染，估計細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)就開始犯愁了，細(xì)胞培養(yǎng)的老手都知道，支原體污染非常不易察覺。有的實驗室被支原體污染后，如果不進(jìn)行有效*的支原體清除，該實驗的細(xì)胞培養(yǎng)很難進(jìn)行下去，細(xì)胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無法進(jìn)行正常實驗，有的實驗室甚至只能指望換細(xì)胞間。那么怎樣才能有效檢測并清除支原體污染呢?

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實驗操作；細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒（均為探針法檢測），依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別，

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染，可引起細(xì)胞的污染。應(yīng)定期對工作區(qū)域進(jìn)行消毒。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

 

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補充驗證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。